Blog single photo

Het ontwerp, de constructie en karakterisering van nieuwe nanovibrationele bioreactoren voor osteogenese - Phys.org

Spuitgietgereedschapontwerp en matrijsvulanalyse met behulp van simulaties voorafgaand aan de fabricage (A) Een geëxplodeerd aanzicht van het matrijsgereedschap met kweekplaat wordt getoond om de belangrijkste componenten van het matrijsinterface en uitwerpsysteem te illustreren. (B) toont de analyse van de matrijsvulling die schat dat de holte van het onderdeel in het gereedschap 3,65 seconden nodig heeft om volledig te vullen, waardoor een defectvrij onderdeel ontstaat. Credit: Scientific Reports, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4              In de regeneratieve geneeskunde streven wetenschappers ernaar om technieken die de betrokkenheid van stamcellen kunnen beïnvloeden, aanzienlijk te verbeteren. Mechanische stimulatie van mesenchymale stamcellen (MSC's) op nanoschaal kan bijvoorbeeld mechanotransductiepaden activeren om osteogenese (botontwikkeling) in 2-D- en 3-D-kweek te stimuleren. Dergelijk werk kan een revolutie teweegbrengen in bottransplantatieprocedures door transplantaatmateriaal te maken uit autologe of allogene bronnen van MSC's zonder het fenomeen chemisch te induceren. Vanwege de toenemende biomedische interesse in dergelijke mechanische stimulatie van cellen voor klinisch gebruik, hebben zowel onderzoekers als clinici een schaalbaar bioreactorsysteem nodig om consistent reproduceerbare resultaten te leveren. In een nieuwe studie die nu is gepubliceerd op Scientific Reports, heeft Paul Campsie en een team van multidisciplinaire onderzoekers op de afdelingen van biomedische technologie, informatica, fysica en moleculaire, cel- en systeembiologie een nieuw bioreactorsysteem ontwikkeld om aan de bestaande vereisten te voldoen.                                                       Het nieuwe instrument bevatte een trilplaat voor bioreacties, gekalibreerd en geoptimaliseerd voor nanometertrillingen bij 1 kHz, een voedingseenheid voor het genereren van een 30 nm trillingsamplitude en op maat gemaakte zes-wells cultureware voor celgroei. De kweekartikelen bevatten magnetische inzetstukken voor bevestiging aan de magnetische trillingsplaat van de bioreactor. Ze beoordeelden osteogene eiwitexpressie om de differentiatie van MSC's na initiële biologische experimenten in het systeem te bevestigen. Campsie et al. uitgevoerd atomaire krachtmicroscopie (AFM) van de 3-D gelconstructies om te verifiëren dat harding van de gel niet heeft plaatsgevonden tijdens trillingsstimulatie. De resultaten bevestigden dat celdifferentiatie het resultaat was van nanovibratiestimulaties die alleen door de bioreactor worden geleverd. De toenemende incidentie van skeletletsel als gevolg van leeftijdsgerelateerde aandoeningen zoals osteoporose en artrose is een maat voor de afnemende kwaliteit van het menselijk leven. De ontwikkeling van behandelingen voor verhoogde botdichtheid of fractuurgenezing zijn hoofddoelen voor het regeneratieve potentieel van mesenchymale stamcellen (MSC's). Onderzoekers hebben gecontroleerde osteogenese (botontwikkeling) van MSC's aangetoond via mechanische stimulatie met behulp van verschillende methoden, waaronder passieve en actieve strategieën. Passieve methoden veranderen typisch de substraattopografie om het celadhesieprofiel te beïnvloeden, terwijl actieve methoden blootstelling aan verschillende krachten van externe bronnen omvatten.                               FEA-analyse werd uitgevoerd in ANSYS-werkbank 17.1 om de harmonische respons te bepalen bij 1 kHz op de bovenplaatopstelling van dertien en vijftien piëzo-array. (A) Diagram van dertien piëzo-array. (B) Diagram van vijftien piëzo-array. (C) Voorspelde nanoschaalverplaatsing van dertien piëzo-array bij 1 kHz. (D) Voorspelde nanoschaalverplaatsing van vijftien piëzo-array bij 1 kHz. Credit: Scientific Reports, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              Het huidige werk van Campsie et al. voornemens zijn vooruitgang te boeken met reeds bestaande ontwerpen voor de gecontroleerde osteogenese van MSC's om een ​​voor Good Manufacturing Practice (GMP) compatibel systeem te construeren dat van toepassing is op kleinschalige klinische proeven. Bij de bouw gebruikte het team laserinterferometrie om de trillingsverplaatsing nauwkeurig te meten vanaf de bovenplaat van de bioreactor en binnen de putten die worden gebruikt voor cultuurmateriaal om de apparatuur te valideren die ze hebben ontwikkeld op basis van eindige elementenanalyse (FEA) -modellen. Het team gebruikte een directe digitale synthesegolfvorm (DDS) -generator en een reconstructiefilter om hoogfrequente componenten van de DDS-uitgang te verwijderen om een ​​zuivere sinusuitgang van 1 kHz te genereren voor precieze nanovibraties.                                                                                      Het onderzoeksteam heeft de werking van het bioreactorsysteem gevalideerd door biologische experimenten uit te voeren om de osteogene eiwitexpressie van MSC's te kwantificeren die worden blootgesteld aan nanovibratiestimulatie. Ze voerden AFM-metingen uit op de collageengel die in de experimenten werd gebruikt om te bepalen dat trillingen van het cultuurmateriaal in de gel werden overgebracht. Vervolgens toonden ze aan dat de stijfheid van de gel niet significant toenam in reactie op de nanovibraties die plaatsvonden.                               Watercontacthoekmetingen van PP cultuurmateriaal na verschillende doses plasmabehandeling en microscopiebeelden van MG63-cellen (osteogene cellen) op PP- en polystyreen (PS) 6-wells platen. Een grafiek van WCA-metingen na plasmabehandeling (A) laat zien dat ten minste 30 seconden nodig is om de WCA aanzienlijk te veranderen tot een niveau dat cellen zou kunnen laten hechten en prolifereren. Afbeeldingen van (B) niet-hechting van MG63-cellen op de PP 6-wells plaat voorafgaand aan plasmabehandeling, (C) hechting en proliferatie van MG63-cellen op met plasma behandelde PP 6-wells plaat en (D) MG63-cellen gekweekt op een standaard Corning PS plaat met 6 putjes. Credit: Scientific Reports, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              Campsie et al. heeft de bioreactor geconstrueerd met specifieke materiaalkeuzes en bevestiging van cultureel materiaal om optimale trillingen op nanoschaal te leveren tussen de frequenties van 1 Hz en 5 kHz. Ze zorgden ervoor dat de resonantiefrequentie van het apparaat ruim boven de werkfrequentie lag om resonante versterking of demping te voorkomen. Om de juiste afmetingen van het apparaat te bepalen, heeft het onderzoeksteam FEA uitgevoerd met behulp van ANSYS Workbench-software. De wetenschappers creëerden de bioreactoren goedkoop door 13 tot 15 piëzo-arrays te gebruiken voor de constructie. Het productontwerp liet verschillende afwisselende banden van minimale en maximale verplaatsing voor cellen toe om inconsistente trillingsniveaus in de cultuurgoed te ontvangen. Het team schatte de intrinsieke resonantiefrequentie van de piëzo-aandrijvingen en andere apparaatcomponenten om hun impact op de experimentele opstelling te begrijpen. Het onderzoeksteam heeft vervolgens de oppervlaktechemie van het plastic cultuurmateriaal aangepast om celadhesie en -proliferatie te bevorderen met behulp van plasma-oppervlakactivatie om de oppervlakte-energie van het polymeer te verhogen. Na vijf minuten plasmabehandeling op luchtbasis kweekten ze menselijke osteoblastachtige cellen om een ​​verhoogde celhechting aan de kweekwaar waar te nemen. Ze maten de watercontacthoek van het polymeer om de oppervlakte-energie van de modificatie en oppervlaktebevochtigbaarheid te bepalen. De wetenschappers hebben een proof-of-principle aangetoond met betrekking tot de plasma-activering van polymeercultuurgoed en de invloed ervan op de bevochtigbaarheid van het oppervlak voor een gunstige celhechting. Ze streefden ernaar om oppervlakken van cultureware op dezelfde manier verder te ontwikkelen om hun stabiliteit en houdbaarheid te garanderen.                               BOVEN: Bioreactor-trillingsplaat met spuitgegoten PP 6-wells kweekmateriaal. (A) De verbeterde versie van de bioreactor heeft een lichtere basis, draaggrepen en een verzonken bovenplaat, samen met een voeding ontworpen om een ​​sinusgolf van 1 kHz en 30 nm nm-amplitude af te geven. (B) Spuitgegoten PP-cultuurgoed met ingebouwde halbach-ferrietringmagneten in de bodem van elk putje. De dikte van het frame en de wanden van de putten is 1,5 mm. BODEM: meetopstelling en uitgangssignaal voor interferometer. (A) Om verplaatsingen op nanoschaal te meten zendt de interferometer een laserstraal uit de laserkop die terug wordt gereflecteerd naar de fotodetector (ook in de laserkop) van het te meten object. Door analyse van het geproduceerde optische interferentiepatroon kan de verplaatsing worden verkregen. (B) Voorbeeld van de tijdreeksgegevens gemeten door de interferometer. (C) Voorbeeld van een FFT-analyse van de tijdreeksgegevens. De 1? KHz-piek van de bioreactor is duidelijk te zien en er is ook een grote piek bij 750? Hz, maar dit signaal wordt geproduceerd door de referentiespiegel van de interferometer die constant wordt geëxciteerd met een vaste frequentie om de controle te verkrijgen signalen. Credit: Scientific Reports, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              Het onderzoeksteam heeft het ontwerp van de bioreactor in het huidige werk aanzienlijk verbeterd om een ​​lichtere basis te vormen in vergelijking met het prototype dat ze eerder presenteerden. Ze gebruikten een AD9833 stroomgolfvormgenerator voor stroomvoorziening met eenvoudige afstemming en handhaafden de juiste filtering om een ​​zuiver 1 kHz sinusgolfsignaal af te leiden. De onderzoekers verkregen een vermogensspectrum van het pre- en post-gefilterde signaal om de vermogensspectrale dichtheid van de generator te schatten. Ze verifieerden de FEA-modellering en kalibratie van de bioreactor met behulp van een laserinterferometer om nanoschaalveranderingen in verplaatsing te bepalen. De wetenschappers gebruikten prismatische reflecterende tape gehecht aan het bodemoppervlak van elke put om de afmetingen van de kweekput te meten die magnetisch aan de bioreactor waren bevestigd. Deze technologie heeft een enorme reikwijdte om een ​​3-D gemineraliseerde matrix te genereren uit MSC's die in een collageengel zijn gezaaid om botsteigers te vormen. Gekweekte cellen ontvingen bijvoorbeeld een periodieke versnellingskracht tijdens vibratie, die op het celmembraan en cytoskelet inwerkte om osteogenese te induceren. Het effect kan ook verband houden met de stijfheid van de omgeving in de celcultuurmedia, die in plaats daarvan invloed heeft op stamceldifferentiatie en osteogenese in MSC's induceert. Om de oorzaak te onderscheiden, Campsie et al. gebruikte AFM om elke verandering in stijfheid te detecteren terwijl ze de collageengel nanoveerden. Ze namen geen significante effecten van rekharding in de gel waar en de Young's modulus handhaafde waarden van zachte collageengels; waardoor celdifferentiatie alleen aan nanovibratie wordt toegeschreven.



footer
Top